一、基本原理高效液相色譜（HPLC）法是以高壓下的液體為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來析。高效液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同，它們之間的重大差別在于作為流動相的液體與氣體之間的性質的差別。二、高效液相色譜分析原理（1）高效液相色譜分析的流程：由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經流量與壓力測量之后，導入進樣器。被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數(shù)據處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。（2）高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。開始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。三、工作原理儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據以圖譜形式打印出來。四、HPLC的特點和優(yōu)點HPLC有以下特點：高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0 ml/min。高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經典液相色譜相比有以下優(yōu)點：速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
